Вы набираете предложение и понимаете, что допустили одну букву с ошибкой. Ошибка изменит смысл всего предложения, поэтому вы наводите курсор на неправильную букву, нажимаете «Backspace» и вводите правильный символ. Удивительно, но теперь этот подход был воспроизведен в лабораториях: ученые стали писателями, а ДНК — посланием, которое необходимо исправить. Это стало реальностью благодаря CRISPR-Cas9 — новой технологии, полностью покорившей научное сообщество за последние несколько лет.
В начале 2013 года несколько групп ученых показали, что системы CRISPR/Cas могут работать не только в бактериальных клетках, но и в клетках высших организмов, а это значит, что системы CRISPR/Cas позволяют исправлять неправильные последовательности генов и тем самым лечить наследственные заболевания человека.
Адаптация «Нобелевского» редактора генома CRISPR/Cas была разработана китайскими молекулярными биологами, чтобы они могли обнаруживать присутствие раковых клеток внутри тел пациентов. Молекулярные биологи Университета Чжэнчжоу (Китай) под руководством Чжан Кайсена разработали высокоточную диагностическую систему, способную обнаружить даже самые незаметные следы опухолей у пациента с помощью одной из версий геномного редактора. Экзосомы постоянно выделяются в окружающую среду опухолевыми клетками, что и является основой новой технологии. Молекулярные сигналы, включая опухолевые биомаркеры, передаются изолированными микроскопическими пузырьками, как определили биологи.
Группа исследователей под руководством Чжан Кайсяна разработала наночастицы жира, которые могут проникать в экзосомы и вводить цепи РНК, идентифицирующие опухолевые биомаркеры, вместе с модифицированным белком Cas13. В данном случае эти молекулы активно производятся опухолевыми клетками, а не здоровыми. Ученые модифицировали белок Cas13 так, что, когда он видит «мишень» РНК поблизости, он реагирует с другим компонентом жировых наночастиц, содержащим светящиеся метки. Эти метки ярко светятся в результате взаимодействия вещества с геномным редактором. Таким способом можно обнаружить даже небольшое количество опухолевых клеток. Используя этот подход, ученые разработали наночастицы, которые могут обнаруживать молекулы РНК miR-21, образованные солидными опухолями. Новая диагностическая система смогла обнаружить опухолевые клетки даже тогда, когда во время экспериментов на культурах клеток рака молочной железы в питательной среде присутствовало всего несколько сотен экзосом с миР-21. Ученые пришли к выводу, что это позволяет выявить рак на ранней стадии.
Профессор Тель-Авивского университета ДэнПир возглавил исследование, в ходе которого была предпринята попытка уничтожить ген PLK1, способствующий чрезмерной пролиферации опухолевых клеток, с помощью системы CRISPR/Cas9. В разработанной ими системе использовались две молекулы РНК. Нуклеаза Cas9 кодируется матричной молекулой РНК. Направляющая РНК (сгРНК) — вторая молекула (Розенблюм Д.2020). Это приведит нуклеазу к гену PLK1, где она делает двухцепочечный разрыв в нужном месте, вызывая разрушение гена. Остается только одна проблема: доставка этих РНК в опухолевые клетки. Молекулы липидов заряжены положительно и отрицательно, а нуклеиновые кислоты – отрицательно. Отрицательно заряженная мембрана живых клеток сливается с «пузырем» РНК или ДНК. В зависимости от цели нуклеиновая кислота будет высвобождаться в цитоплазму. С помощью этого метода в клетки можно доставлять небольшие молекулы нуклеиновых кислот. Чтобы найти носители наночастиц, авторы искали липидные молекулы. Были проанализированы четыре молекулы, линкерные части которых отличались друг от друга. В последующих экспериментах с липидными наночастицами успешно образовались комплексы РНК.
Чтобы сделать РНК матрицы Cas9 более стабильной, авторы добавили 5-метоксиуридин. Кроме того, эта модификация предотвращает реакцию иммунной системы на чужеродную РНК. По словам авторов, они выбрали два типа опухолевых клеток, соответствующие наиболее опасным видам онкологических заболеваний. На мышиной глиоме, искусственно индуцированной путем активации онкогенов h-RAS и Akt, были получены клетки первого типа — линии 005. Именно эти клетки вызывают агрессивные глиобластомы у мышей, когда их вводят в их организм. Продолжительность жизни человека с таким диагнозом составляет 15 месяцев, а пятилетняя выживаемость составляет всего 3%. Клетки аденокарциномы яичника использовали для создания второй клеточной линии Ovcar8. При введении мышам эти клетки образуют многочисленные метастазы из-за устойчивости к химиотерапевтическим препаратам. Шансы на выживание существенно снижаются, когда рак яичников обнаруживается на стадии метастазирования. Недавно разработанная система была успешно использована для модификации культур клеток 005 и Ovcar8: 84% клеток 005 и 91% клеток Ovcar8 имели разрушенный ген PLK1. Через 48 часов деление клеток приостанавливалось, а через 96 часов жизнеспособность клеток значительно снижалась. Несмотря на этот обнадеживающий результат, необходимо было определить, могут ли мыши переносить наночастицы, прежде чем тестировать их на реальных опухолях. Мышам вводили липидные наночастицы того же состава, которые содержали комплексы РНК, предназначенные для разрушения гена зеленого флуоресцентного белка (GFP). Поскольку у мышей этот ген отсутствует, такие частицы можно использовать в качестве контроля. После введения мышам проводили общий анализ крови и измеряли уровни печеночных ферментов (для проверки токсичности наночастиц) и провоспалительных цитокинов (для определения иммунного ответа). У мышей не было выявлено существенных отклонений от нормы. Однако этот аспект следует изучить глубже в доклинических исследованиях.
Наконец, мышам вводили наночастицы, содержащие противораковые РНК. В качестве первого шага для тестирования системы была использована индуцированная глиобластома. Шестьдесят восемь процентов клеток были повреждены через два дня после введения РНК Cas9/sgPLK1. Несколько опухолевых клеток показали признаки апоптоза через три дня после введения в них наночастиц. Более того, неделящиеся нейроны вокруг опухоли, где активность гена PLK1 уже была низкой, остались живы. Наконец, мышам с индуцированной глиобластомой вводили наночастицы РНК Cas9/sgPLK1 и изучали их выживаемость, а также уменьшение размера опухоли. Через 60 дней после индукции опухоли 30% мышей, получивших активный комплекс РНК, были живы. К 40-м суткам все животные контрольных групп погибли. Произошло значительное уменьшение размера опухоли и увеличение выживаемости в среднем с 32,5 дней до более чем 48 дней. В результате такого успеха авторы перешли к работе с клетками аденокарциномы яичника. Помимо проверки того, работает ли система на других опухолях, также необходимо было проверить его возможности. Например, можно ли воздействовать на опухолевые клетки напрямую?
При некоторых видах рака, таких как метастатические или злокачественные заболевания системы кроветворения, препарат необходимо вводить системно, чтобы достичь всех клеток-мишеней. Как уже было сказано, химиотерапия воздействует на весь организм, что является очевидным недостатком этого метода. Из-за особенностей метаболизма многие липидные наночастицы попадают в печень в системы доставки на основе липидных переносчиков. В результате генетическая модификация клеток печени с помощью CRISPR/Cas9 обычно оказывается весьма успешной, достигая 70% случаев. Если вы хотите модифицировать клетки в других органах, вам нужно делать инъекции непосредственно в опухоль или использовать какой-то трюк, чтобы редактирование генома происходило только в клетках-мишенях. Авторы исследования ранее разработали метод решения этой проблемы. В состав липидных частиц, несущих нуклеиновые кислоты, также был включен липопротеин, способный взаимодействовать с антителами. В свою очередь, это антитело взаимодействует с белком, характерным для определенного типа клеток. EGFR представляет собой рецептор эпидермального фактора роста, обнаруженный на поверхности клеток аденокарциномы яичника, включая клетки Ovcar8. Другие клетки организма также содержат его, но больше всего его содержат раковые клетки. С помощью РНК Cas9/sgPLK1 антитела прикрепляются к липидным наночастицам с помощью этого белка. Для формирования опухолей мышам в брюшную полость вводили клетки Ovcar8, а через 10 дней – липидные наночастицы, содержащие РНК Cas9/sgPLK1 и антитела к рецептору EFGR. Восемьдесят два процента клеток были повреждены через два дня после введения гена PLK1. Выживаемость мышей с опухолями увеличивалась примерно на 80%, когда модифицированные клетки глиобластомы умирали в результате апоптоза.
Можно с осторожным оптимизмом сказать: разработана новая система борьбы с онкологическими заболеваниями. Соответствующая подобная направляющая РНК может быть использована для модификации различных онкогенов. Этот процесс также позволяет исправлять мутации и разрушать гены. Во-вторых, антитела можно использовать и при других типах опухолей. Сверхэкспрессия рецептора HER2 может быть использована в качестве мишени для направления антител, например, при некоторых типах рака молочной железы. Кроме того, авторы продемонстрировали, что одной инъекции РНК Cas9/sgPLK1 в липидные наночастицы было достаточно для достижения хорошего результата. Наконец, эту систему липидных наночастиц можно использовать для генной терапии и в других случаях, помимо онкологии.
Hu, Y., Zhou, Y., Zhang, M., Ge, W., Li, Y., Yang, L., Wei, G., Han, L., Wang, H., Yu, S., Chen, Y., Wang, Y., He, X., Zhang, X., Gao, M., Yang, J., Li, X., Ren, J., & Huang, H. (2021). CRISPR/Cas9-Engineered Universal CD19/CD22 Dual-Targeted CAR-T Cell Therapy for Relapsed/Refractory B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Clinical Cancer Research: An Official Journal of The American Association for Cancer Research, 27(10), 2764–2772. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-20-3863
Илья Андреевич Кругликов
